Книга Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - Журнал «Домашняя лаборатория»

стабилизирующих липидные слои.

С особым успехом для этих целей используется ПЭГ с молекулярным весом от 1500 до 7500.

Лектины и антитела — двух- или поливалентные соединения, и их агглютинирующая функция связана со способностью одной молекулы какого-либо из этих соединений взаимодействовать с рецепторами, находящимися на поверхности двух клеток, что и приводит к образованию связи между клетками. Достаточное количество таких молекулярных связей может удерживать клетки вместе, препятствуя их расхождению либо в результате броуновского движения, либо в результате электростатического отталкивания, либо в результате активной миграции клеток.

На втором этапе гликопротеиды, расположенные на поверхности, начинают высвобождаться из участков мембраны, лежащих между вирионами, и притягиваются к местам прикрепления вирусных частиц. Углеводные компоненты — наименее изученная часть клеточной поверхности. В мембранах они встречаются в виде нейтральных сахаров, а также ковалентно связываются с липидами или белками. Именно в таком виде они активно участвуют во многих биологических процессах. Установлено, что гликопротеиды определяют антигенную специфичность клеток, несут отрицательный заряд, характерный для клеток при физиологически нейтральных pH, принимают участие в распознавании и адгезии клеток, определяют рецепторные участки для вирусов, бактерий, агглютинирующих агентов, принимают участие в процессе регуляции проницаемости мембран для ионов. Эти свойства и определяют их участие в слиянии клеток.

Углеводы препятствуют слиянию клеток, так как разделяют липидные слои мембран, не давая им соприкасаться, так как на поверхности нормальной клетки рецепторные участки расположены редко или поодиночке. В результате трансформации вирусом происходит их объединение в группы. Гликопротеиды мигрируют в мембране к месту адсорбции вируса, оставляя свободными соседние участки, где и происходит слияние клеток. В некоторых случаях в удалении углеводных групп, препятствующих слиянию клеток, принимают участие лизосомные ферменты. При этом происходит соединение лизосом или пузырьков АГ с плазматической мембраной, и локальное высвобождение гликозидаз. Такая лизосомная активность может быть запрограммирована (в гаметах, миобластах, макрофагах, т. е. клетках, сливающихся в естественных условиях) или вызвана экспериментально при индуцированном слиянии клеток.

Третий этап — мицелизация обнажившихся липидов двух противолежащих мембран. Мицеллы — липидные капли, где молекулы липидов гидрофильными головками обращены к воде, а гидрофобные "хвосты" жирных кислот спрятаны внутрь. Этот процесс усиливается при высоких значениях pH и высокой концентрации ионов кальция. В обеих клетках начинается эндоцитоз вирусных частиц.

Четвертый этап — слияние мембран. Благодаря мостикам, образуемым Са2+, размер мицелл уменьшается. Под действием АТФ и Са2+, активизируются микрофиламенты. Возникший цитоплазматический мостик стабилизируется и расширяется благодаря функционированию микрофиламентов. На последних этапах слияния клеток важную роль играет наличие АТФ. АТФ образуется благодаря деятельности митохондрий. Поликарионы, образующиеся при слиянии двух или трех клеток, представляют собой не бесформенные раздутые или двулопастные шары цитоплазмы, а принимают форму, характерную для одной из родительских клеток или промежуточную между ними. Форму клетки определяют микротрубочки и микрофиламенты. В процессе слияния клеток микрофиламенты актиномиозинового типа, расположенные под цитоплазматической мембраной, принимают непосредственное участие, так как обеспечивают объединение цитоплазм слившихся клеток и стабилизацию вновь образованной системы. Однако, формирование цитоскелета — энергозависимый процесс, требующий большого количества АТФ. Видимо, этим обусловлено присутствие митохондрий в местах слияния клеточных мембран.

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА

Функциональная структура антител

Слияние клеток лежит в основе получения гибридных клеток, продуцирующих антитела. Антитела — белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Иммунная система вырабатывает специфические антитела на огромное множество антигенов. В основе такой способности лежит наличие большого многообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела с узкой специфичностью. В совокупности называемые иммуноглобулинами (Ig), антитела составляют один из главных белковых компонентов крови — по весу около 20 % суммарного белка плазмы.

В качестве антигенов выступают различные вещества: клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, в некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получивших название антигенных детерминант. В случае белковой молекулы антигенном детерминантом являются участки поверхности, содержащие около 5 аминокислотных остатков.

Простейшие молекулы антител имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками — по одному на конце каждой из двух "ветвей". Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены:

Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок:

Тенденция больших иммунных комплексов к осаждению (преципитации) удобна для выявления антител и антигенов. Образование таких комплексов может приводить к агглютинации (склеиванию) молекул. Это явление лежит в основе определения групп крови, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности — реакция гемагглютинации.

Молекула антитела образована четырьмя полипептидными цепями (рис. 33).

Рис. 33. Строение антитела

Две из них — идентичные легкие (L-цепь, из 220 аминокислот), а две — тяжелые (Н-цепь, из 440 аминокислот). Все четыре цепи соединены между собой нековалентными и ковалентными (дисульфидами) связями. Антиген-связывающие участки образуются за счет одной Н и одной L-цепи. Эффективность реакций связывания антигена возрастает благодаря гибкому шарнирному участку антитела, который позволяет изменять расстояние между двумя антиген-связывающими участками. Шарнирный участок находится на Н-цепи. Н-цепь образует также "хвостовой" участок молекулы, который содержит также одну или несколько олигосахаридных цепочек, функция которых неясна. Как L, так и Н-цепь построены из повторяющихся сегментов, или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу (эпитоп). Эти участки также могут выступать в качестве антигенных детерминант и, соответственно, связываться другими антителами.

Получение моноклональных антител

Как образуются антитела? Иммунный ответ — сложный процесс межклеточных взаимодействий различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.

Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.

Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав