Книга Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - Журнал «Домашняя лаборатория»

в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т. е. состоят из "белых" и "черных" клеток.

Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными. Такие белки называются изоферментами, и их можно разделить с помощью электрофореза. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода — не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.

2. Инъекционный — был разработан Р. Гарднером в 1968 г.

Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона — рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.

Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: М. muskulus и М. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту М. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона М. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку М. muskulus и благополучно развивались там, а в организме М. caroli погибали спустя две недели.

Межвидовые химерные зародыши между мышью и крысой путем агрегации были получены только в 70-х годах. Первые химерные животные были получены только в 1973 году Р. Гарднером и М. Джонсоном. Успех этих экспериментов позволил приступить в 80-х годах к созданию химерных сельскохозяйственных животных. Выяснилось, что агрегационный метод неприемлем для получения химер крупного рогатого скота. Химер телят Bos indicus + Bos taurus удалось получить только инъекционным методом.

В 1984 году были получены межвидовые химеры между овцой и козой — овцекозы, причем практически одновременно в Англии и ФРГ. Использовались оба метода. Половым путем овцы и козы не скрещиваются, так как имеют разный набор хромосом: коза 2n = 60, овца 2n = 54. В ФРГ в 1985 году были получены химерные телята после агрегации половинок 32-клеточных эмбрионов от коров швицкой (бурой) и голштино — фризской пород. В фенотипе химер сочетались обе масти — бурая и черно — пестрая.

Химерные животные не передают потомкам генетическую мозаичность. У них происходит расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются. Но на протяжении 1 поколения хозяйственно ценные признаки поддерживаются, поэтому можно, например, сочетать как молочную, так и мясную продуктивность.

Химерность довольно часто встречается и у растений. Как правило, она существует в скрытом виде, не проявляясь фенотипически. Однако пластидные мутации позволяют увидеть ее непосредственно на растении. Чаще всего спонтанная химерность наблюдается у гетерозиготных растений. Различные клеточные типы четко разделены в пространстве, образуя отдельные слои при делении апикальных меристем. Примером видимой мутации хлоропластов и образования химерного растения является пестролистность или появление секторов ткани другого цвета.

Механизм слияния клеток

Для индукции слияния клеток используются вещества различной природы. Ионы Са2+, полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай.

Лизолецитин — поверхностно-активное вещество липидной природы, продукт деградации лецитина путем обработки последнего фосфолипазой А. Лизолецитин повреждает мембраны и токсичен для живых систем. Цитотоксический эффект этого вещества можно уменьшить снижая его концентрацию или добавляя во время обработки альбумин.

Моноолеат глицерина также соединение липидной природы, но его повреждающее действие менее выражено, а частота слияния клеток при применении этого вещества возрастает в 4–7 раз по сравнению со спонтанным процессом. К другим агглютинирующим агентам, способность которых вызывать слияние клеток, была исследована специально, относятся лектины растений и антитела.

Преимущество вируса Сендай как сливающего агента заключается в полном отсутствии цитотоксического эффекта. Вирус перед употреблением инактивируют, облучая ультрафиолетовой лампой в течение 5 минут, при этом он теряет способность к размножению, но сохраняет способность сливать клетки. Вирус Сендей имеет два недостатка:

— необходимость наращивать, титровать, концентрировать и инактивировать вирус;

— клетки растений и грибов не имеют рецепторов к этому вирусу, поэтому он неприменим для их гибридизации.

Первый этап слияния (рис. 32) — сближение мембран соседних клеток и уста новление между ними тесного контакта. Мембраны должны быть приближены друг к другу на расстояние в несколько ангстрем так, чтобы между ними стали возможны взаимодействия, подобные гидрофобным связям. Вызывают подобное сближение агенты, индуцирующие агглютинацию клеток. Миксовирусы, например, вирус Сендай, наряду с другими вирусами, которые не обусловливают слияния, прежде всего, вызывают агглютинацию клеток, т. е. достаточно тесное их сближение, необходимое для успешного последующего слияния.

Рис. 32. Этапы слияния клеток

(по Н. Рингертцу, Р. Сэвиджу, 1979):

А — 1-й этап, сближение цитоплазматических мембран: 1 — гликопротеиды, 2 — липиды, 3 — плазматические мембраны, 4 — митохондрии, 5 — микрофиламенты, 6 — частицы вируса Сендай;

Б — 2-й этап, выход гликопротеидов и обнажение липидных слоев мембраны;

В — 3-й этап, образование мицелл;

Г — начало 4-го этапа, слияние мембран, образование цитоплазматических мостиков.

Полиэтиленгликоль также вызывает агрегацию клеток, хотя механизм действия его неизвестен. Возможно, благодаря тому, что в водном растворе ПЭГ несет небольшой отрицательный заряд, молекулы этого размера достаточно велики, чтобы между клетками возникали электростатические связи. Подтверждением этой гипотезы является усиление агглютинации клеток, вызываемой ПЭГ: двухвалентные ионы, по-видимому, образуют мостики между ПЭГ и отрицательно заряженными углеводами, находящимися на клеточной поверхности. Согласно другой гипотезе, протопласты сливаются в результате дегидратации. Поглощение воды индуцирует образование пор на поверхности мембраны и происходит перетекание внутриклеточного материала. После слияния участки с порами сохраняются некоторое время. Существует два предположения, объясняющие возникновение пор:

1. При высокой концентрации ПЭГ (20–30 %) вся свободная вода поглощается им, вызывая разрывы в мембране;

2. ПЭГ уменьшает полярность воды, что вызывает перераспределение полярных и гидрофобных компонентов мембраны,