Книга Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - Журнал «Домашняя лаборатория»

контроль клеточного деления каким-то образом связан с организацией цитоскелета. Хотя механизм и функции этой связи не ясны, можно думать, что зависимость деления клеток от их прикрепления, вероятно, позволяет ткани сохранять целостность и предотвращает пролиферацию клеток, обособившихся от нормального окружения. Цикл прикрепления и открепления, вероятно, позволяет перегруппировать адгезивные контакты как между клетками, так и между клетками и матриксом, чтобы встроить вновь возникшие дочерние клетки в ткань, перед тем как они смогут начать следующий цикл деления. Ослабление контактов, видимо, составляет важную особенность пролиферативного поведения большинства типов клеток. Например, в ранней стадии реакции фибробластов на ростовой фактор отмечается разрушение их фокальных контактов. Потеря управляемости роста у раковых клеток почти всегда связана с необратимым уменьшением клеточной адгезивности, которое проявляется также в потере фокальных контактов при выращивании таких клеток в культуре.

Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформация — процесс необратимый и, очевидно, включает генетические изменения в той специфической части наследственной информации, которая контролирует неопластический фенотип, добавляемый к трансформированному геному хозяина. Изменение ростовых свойств является одной из адаптивных особенностей, позволяющей клеткам пролиферировать в условиях, неблагоприятных для нетрансформированных клеток. Таким образом, в условиях, которые ограничивают рост нормальных клеток, трансформированные клетки будут расти до более высокой плотности популяции, что, по-видимому, будет связано с их пониженной потребностью в факторах роста. Существуют доказательства, что основное изменение при трансформации связано с изменением транспорта питательных веществ через клеточную мембрану, а это, в свою очередь, может сделать клетки менее зависимыми от «геометрических» факторов роста.

Трансформированные клетки способны расти в условиях, в которых геометрические характеристики, а именно отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Следовательно, трансформированные клетки будут расти в суспензионных культурах, образуя сферические клоны. Так, трансформированные клетки, будучи введенными иммунологически толерантным животным в относительно небольших количествах, могут образовывать опухоли. По этой причине трансформация иногда приравнивается к злокачественным изменениям. Трансформация может быть или вирусной, или «спонтанной». Большинство исследований выполнены с клетками, подвергнутыми вирусной трансформации. Когда при этом использовали хорошо известные трансформирующие вирусы, такие, как вирусы SV40 и полиомы, то свойства трансформированных клеток проявлялись очень наглядно и были описаны подробно. Аналогичные изменения, наблюдавшиеся после спонтанной трансформации, привели к предположению, что такая трансформация является результатом активации последовательностей генов (онкогенов), уже присутствовавших в геноме трансформированной до этого клетки, сходной с таковой в вирусном геноме. Многие исследования подтвердили, что спонтанно трансформированные клетки имеют такую же последовательность оснований в ДНК, как и в клетках, трансформированных вирусами. Но в одной из работ было показано, что аналогичные (может быть, неразличимые) изменения вызываются также точечными мутациями в нормальных генах. Старение характерно для клеток, имеющих ограниченный потенциал пролиферации, то есть низкую плотность насыщения при идеальных условиях культивирования. Примером могут служить линии диплоидных клеток человека. Повышенная способность к росту трансформированных клеток означает, что трансформация преобладает над процессом старения.

Старение, безусловно, зависит от генетических факторов, так как каждый вид имеет характерную продолжительность жизни, но вариабельность внутри популяций по этому показателю свидетельствует также о влиянии фенотипа. При адаптировании диплоидных клеток человека (линия WI38) уже с самого начала было показано, что культивируемые клетки могут проявлять феномен старения и имеют ограниченное время жизни (50±10 удваиваний популяции). Зависящие от возраста изменения, которые при этом наблюдались, включали удлинение межмитотических интервалов (19±25 % — 31±41 %/час), изменение метаболизма, уровней ферментов и экспрессии продукта. Следует отметить, что не установлено четкой связи между продолжительностью жизни в зависимости от происхождения клетки (мышь, человек) и потенциалом удваивания их клеток в культуре.

Ограниченные по продолжительности жизни клеточные линии, например линии диплоидных клеток фибробластов, не являются идеальными объектами для целей производства, поскольку их должны использовать до того, как в клетках произойдут серьезные изменения старения. В практических отношениях это означает, что период жизни этих клеток, когда их можно применять в целях производства, заключается между 12 и 30 пассажами (в первом случае — для приготовления посевного материала). Трансформированные же клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает такое их преимущество в биотехнологии, как использование в качестве субстрата для генерации различных продуктов в сочетании с более высокими плотностями популяции клеток, более высокими скоростями роста и способностью расти в суспензиях.

Питательные среды и условия культивирования

После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т. е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток.

Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т. д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство pH среды является одним из главных требований условий культивирования.

Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Эти растворы, как и фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта используются также для орошения и промывки клеток при пассировании культур, выделении клеточных линий и других манипуляциях с культурами клеток. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Оно определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 литр раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах эти величины близки. Осмоляльность раствора[73] (осмоль/кг) = Smi*xi, где mi концентрация i-гo растворенного вещества (моль/кг), хi количество частиц, на которые диссоциировала его молекула. Например, для раствора Эрла расчетная величина осмоляльности равна 310.6 мосмоль/кг, реальная 283. Диапазоны pH и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Например, для клонального роста диплоидных фибробластов человека WI38 оптимальны рН = 7.30 + 0.15 и осмоляльность 285 + 40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона цыпленка 7.12 + 0.18 и 300 + 20 соответственно. Для поддержания pH в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: НСО3 = СО2 + ОН, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания pH в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры ведутся вне