Книга Охота на рыжего дьявола - Давид Шраер-Петров

Мои предположения необходимо было проверить экспериментально. Прежде всего: воспроизвести на лабораторных животных модель, соответствующую всем стадиям развития клинической меланомы. В конце 80-х — начале 90-х наиболее популярной была экспериментальная модель меланомы, разработанная доктором И. Фидлером (Отдел биологии рака, Раковый центр, Хьюстон, Техас, США). Сущность ее сводилась к тому, что лабораторных мышей (в данном случае это были не белые, а черные мыши) заражали внутривенно клетками меланомы. Доктор Фидлер в 70-е годы обнаружил эту опухоль, спонтанно возникшую на коже черных мышей, назвал В16 и показал, что меланома может развиваться в клеточной культуре и перевиваться на чувствительных к ней животных (разновидность черных мышей C57BL/6). Особенную популярность получила модель «легочных метастазов» Фидлера: клетки меланомы В16 вводились в вену хвоста и через 14 дней можно было обнаружить множественные первичные очаги в легких, отчетливо различимые на глаз из-за черного пигмента (меланина), активно продуцируемого опухолью. Были ли это истинные метастазы? Известно, что метастазы возникают при распространении микроорганизмов или раковых клеток из одной части организма в другую. В классическом варианте метастазы распространятся из первичной (кожной) меланомы в лимфатические узлы, легкие, костный мозг и другие органы и ткани. В случае модели доктора Фидлера экспериментаторы миновали начальную стадию развития меланомы (первичный очаг) и впрыскивали раковые клетки по кровеносным сосудам прямо в легкие.

Надо было разработать экспериментальную модель, действительно имитирующую все клинические стадии развития меланомы. И, конечно же, первичный очаг должен развиваться на коже. В идеале наблюдать за развитием первичной опухоли лучше всего на коже, лишенной волосяного покрова. В литературе упоминались попытки исследователей воспроизвести первичный очаг на коже ушной раковины C57BL/6 мышей. Меланома возникала. Но из-за близости головного мозга, куда немедленно распространялись метастазы с кожи ушной раковины, мыши так быстро погибали, что модель была мало пригодна для длительных наблюдений, необходимых при химиотерапии или иммунотерапии. Другой безволосой частью тела мыши был хвост. Я нашел, что через 2–3 недели после введения 1 миллиона клеток меланомы В16 в толщу кожи мышиного хвоста возникает первичная опухоль с типичным для меланомы черным пигментом. Меланома увеличивалась в размерах, изъязвлялась к 6-й неделе, а метастазы распространялись в костный мозг и ближайшие лимфатические узлы, затем захватывали легкие и приводили животных к гибели. Таким образом, впервые удалось воспроизвести экспериментальную модель, которая полностью имитировала все три стадии развития клинической меланомы: I. Первичная (кожная меланома). II. Проникновение клеток меланомы в регионарные лимфатические узлы. III. Метастазы в органы (легкие, головной мозг, печень и др.).

Теперь я определенно знал, что надежная модель для дальнейших опытов по лечению мышей с развивающейся меланомой у меня есть. На эти начальные опыты мой шеф доктор Шарма смотрел сквозь пальцы, благо я безотказно продолжал выделение и очистку rBCGF и определял активность очередного образца препарата. Я понимал, что, занимаясь в полную силу проектом по разработке антимеланомной вакцины, я должен буду отойти от основного проекта лаборатории доктора Шармы. Мне нужно было заручиться согласием и финансовой поддержкой руководителя отдела патологии доктора Майзеля. Он предложил обсудить мою модель на научной конференции отдела. Модель была одобрена. Меня перевели в другое лабораторное помещение, где работала иммунологическая группа доктора Куттаба. Мне выделили бюджет на покупку животных и лабораторного оборудования. Я стал в одном лице самостоятельной научной группой. Надо сказать, что мой переход внутри отдела доктора Майзеля от проблемы rBCGF к проекту по изысканию вакцины против меланомы был бы невозможен без научной поддержки директора Ракового центра доктора Калабризи. Вскоре еще одним из энтузиастов моей экспериментальной модели стал замечательный хирург-онколог доктор Гарольд Ванебо, шеф отдела хирургии нашего госпиталя.

Рабочей гипотезой для приготовления антимеланомной вакцины послужила схема приготовления стафилококкового анатоксина (токсоида), разработанная академиком Г. В. Выгодчиковым, когда выделялся и очищался от балластных веществ внеклеточный стафилококковый токсин, который обрабатывался слабым раствором формалина. Многочисленные наблюдения микробиологов показали, что формалин в концентрациях 0.3–0.4 % приводит к нейтрализации микробных токсинов, не нарушая их химической структуры и способности индуцировать выработку антител. Я решил полностью следовать технологии Г. В. Выгодчикова. Новая антимеланомная вакцина получила название ФЕКА (формалилинизированный экстраклеточный антиген).

Начальные опыты сводились к тому, что мышей иммунизировали вакциной ФЕКА строго по схеме, принятой при антистафилококковой вакцинации. ФЕКА вводили подкожно, вначале в возрастающих, а затем в снижающихся дозах. По окончании иммунизации исследовались пробы крови на антитела к ФЕКА. Лимфоциты, полученные из селезенок экспериментальных животных, позволяли судить о степени выработки клеточного иммунитета. Было обнаружено возрастание количества Т4 и Т8 лимфоцитов, которые более активно (по сравнению с неиммунизированными животными) вырабатывали лимфокины и среди них, что особенно важно при лечении меланомы, — интерлейкин 2 (IL-2). Кроме того, в дополнении к стимуляции нарастания Т-лимфоцитов, оказалось, что иммунизация вакциной ФЕКА приводила к увеличению числа лимфоцитов-киллеров (NK), которые способны убивать раковые клетки, в том числе, клетки меланомы. Чрезвычайно интересным оказалось образование специфических антител к внеклеточным антигенам меланомы. Для меня, микробиолога, это означало не только связь с главной профессией, но и подтверждение того, что пораженный меланомой организм способен направить полноценный иммунный ответ (клеточная реакция и образование антител) против раковых клеток так же, как и против микроорганизмов. А это значит, что успех иммунотерапии зависит прежде всего от полноценности вводимой вакцины.

Электрофорез «нативных» (не обработанных формалином) внеклеточных антигенов меланомы в комбинации с «наслоением» антител из сыворотки мышей, предварительно иммунизированных вакциной ФЕКА (методика называется Western blot), показал, что антигенный состав меланомы весьма разнообразен. Растущая опухоль выделяет во внешнюю среду (а значит, и в организм животного или человека) множество белковых веществ (антигенов) с молекулярным весом от 160–110 и 65–67 до 14–18 kD (килодальтон).

Теперь оставалось соединить новую модель экспериментальной меланомы и антимеланомную вакцину/токсоид. Важно было показать, что ФЕКА можно применять как для профилактики, так и для лечения экспериментальной меланомы. С первой целью мышей вначале иммунизировали ФЕКА в течение двух недель, потом им вводили в кожу срединной части хвоста клетки меланомы и сравнивали развитие ракового процесса у иммунизированных и неиммунизированных (контрольных) животных. Другим вариантом экспериментов было лечение мышей вакциной после того, как раковый процесс начал развиваться. Очевидно было, что вакцина эффективна, в особенности, для профилактики развития меланомы.

В 1991 году в Атланте на ежегодной конференции ФАСЕБ, во время представления мною результатов лечения и профилактики экспериментальной меланомы, к моему постеру подошел один из участников конференции. К его пиджаку была приколота карточка с именем: Винсент Хиринг, Национальный Раковый Институт, Национальный Институт Здравоохранения. Это был моложавый (лет сорока) американец, легкий в общении, молниеносно проникающий в глубь научной проблемы. Он изучил мою модель меланомы, пробежался по опытам с применением вакцины ФЕКА и пригласил к своему постеру. Оказывается, доктор Хиринг работал в близкой моим интересам области. Правда, для воспроизведения экспериментальной меланомы он пользовался моделью «легочных метастазов» доктора Фидлера, а для иммунизации мышей — одним из очищенных антигенов меланомы, названном В700-антиген. Доктор Хиринг считал В700-антиген ключевым при создании антимеланомного иммунитета. В серии успешных экспериментов он показал, что моноклонные антитела против этого ракового белка могут защищать лабораторных животных от развития очагов меланомы в легких. Оказалось, что в состав внеклеточных белков (антигенов) меланомы В16, из которых готовилась вакцина ФЕКА, входил антиген с молекулярным весом 65–67 kD, аналогичный В700-антигену доктора Хиринга. Наше научное сотрудничество продолжалось более 15 лет.