Книга Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - Журнал «Домашняя лаборатория»

FeCl3*6H2O — 0.001

агар-агар — 12 г

Среду простерилизовать.

Методики культивирования клеток

Начнем с того, что растительные и животные клетки предъявляют совершенно различные требования к условиям культивирования.

Для животных клеток диапазон оптимального существования очень узок. Это касается и температурных условий, и состава питательных сред (необходимо строго выдерживать pH, молярность и т. д.), и газового состава. Пожалуй, наименее требовательны они к освещению. Для выращивания животных клеток всегда используют готовые фабричные питательные среды, а для длительного поддержания линии нужен термостат. Для некоторых видов клеток газовый состав воздуха можно обеспечить, поместив флаконы с культурой в эксикатор (емкость с притирающейся крышкой) в который также помещают горящую свечку. Когда эксикатор плотно закрыт, свеча затухает сама при концентрации углекислого газа в воздухе 5 %.

Подробнее о условиях культивирования животных клеток и культивировании органов можно прочесть в учебнике по биотехнологии.

Заводить и вести культуру растительных клеток гораздо проще. Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27 °C, в темноте или при освещении. Среды для них — несложные, и их легко приготовить самому. Культивировать можно на твердых питательных средах с добавлением агар-агара, крахмала (методика изложена в главе "питательные среды" или на жидких питательных средах, с использованием мостиков из ваты и фильтровальной бумаги.

Суспензионные культуры растительных клеток поддерживать гораздо сложнее — необходима мешалка для постоянного перемешивания среды. Иначе эксплант погиб нет, в первую очередь, от отсутствия доступа кислорода.

Условия освещения различны в зависимости от поставленных вами задач. Каллусную ткань обычно получают в темноте. Клональное микроразмножение проводят при освещении. В качестве источника света лучше пригодны лампы дневного света. Они не нагревают камеру и имеют более или менее подходящий для растений спектральный состав света.

ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ У РАЗНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ

Каллус — определенным образом организованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллусной ткани контролируется фитогормонами типа ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов происходит дедифференцировка, а под влиянием цитокининов — интенсивное деление, в результате которого образуется ткань.

Спонтанное образование каллусной ткани в природе мы можем наблюдать на месте повреждения. Каллусные клетки затягивают рану, а впоследствии дифференцируются в утраченные ткани растения. Например, когда вы черенкуете розы или другие древесные растения, то на месте нижнего среза, погруженного в воду вырастает мозолеобразое образование — каллус, из которого затем формируются корни, происходит укоренение черенка. Очень часто каллус формируется на поврежденных корнеплодах моркови (особенно в месте среза листьев), на черешках кочанов капусты.

Каллусную ткань также можно получить на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, используя фрагменты самых разных частей растения: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей, семядолей и т. д. Такие фрагменты называются эксплантами.

Получение каллусной ткани из листьев табака

Табак — классический объект для получения каллусной ткани и дальнейших ее исследований. Клетки табака легко дедифференцируются и переходят к делению, образуя быстро растущую каллусную ткань. Кроме того, в каллусной ткани табака легко вызвать регенерацию.

Каллусообразование очень хорошо идет у основания листьев табака, особенно в зоне, примыкающей к срединной жилке. Для получения каллуса пригодны как стерильные, так и нестерильные растения. Нестерильные растения стерилизуют в растворе хлорамина, перекиси водорода или других стерилизующих агентов.

Материалы и оборудование

Растения табака любого возраста, стерильные или нестерильные, этанол, 4 % раствор хлорамина, пробирки со стерильной водой (3 штуки), скальпель, пинцет, спиртовка, кафельная плитка, стаканчик, подставки для инструмента, кисточка, чашка Петри, спички, пробирки со средой МС с добавлением гормонов: 2 мг 2,4-Д и 0,2 мг кинетина на литр среды.

Ход работы

Листья табака промыть в мыльном растворе, отмыть от мыла водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной. Погрузить на 1 минуту в стаканчик с этанолом, вынуть, после чего поместить в чашку Петри и залить стерилизующим раствором на 10 минут. Раствор слить, промыть трижды стерильной дистиллированной водой из пробирок, в каждой из порций держать не менее 5 минут.

Если берутся пробирочные растения, то предварительная стерилизация не требуется.

Стерильные листья табака положить на предварительно обожженую кафельную плитку, стерильным скальпелем вырезать фрагменты у основания листьев, прилегающие к средней жилке, длиной 1–1.5 см, шириной 1 см. Перенести подготовленные участки листьев в пробирки или чашки Петри с питательной средой МС, содержащей гормоны, поместить в термостат при температуре 26 °C. Через 3 недели рассмотреть результат.

Получение и культивирование каллуса из стебля картофеля

Материалы и оборудование

Стерильные растения картофеля в пробирке или нестерильные проростки клубней картофеля, длиной 10–15 см., этанол, 4 % раствор хлорамина, пробирки со стерильной водой (3 штуки), скальпель, пинцет, спиртовка, кафельная плитка, стаканчик, подставки для инструмента, кисточка, стерильная чашка Петри, спички, чашки Петри или колбы со средой МС (с добавлением гормонов — 4 мг 2,4-Д и 0.2 мг кинетина на литр среды).

В ответ на поранение паренхимные клетки, помещенные в питательную среду, содержащую фитогормоны, дедифференцируются, переходят к делению и образуют каллус. У картофеля каллус может быть получен из тканей стебля, листа, клубня, пыльника.

Ход работы

Если используется стерильное растение из пробирки, то горлышко пробирки обжечь спиртом. Пинцетом вынуть стерильное растение из пробирки и поместить его в стерильную чашку Петри. Если берется нестерильное растение, то после промывки его оставляют в чашке Петри. Придерживая крышку в полуоткрытом состоянии, стерильным скальпелем вырезать скальпелем участки стебля длиной 5-10 мм, не захватывая междоузлия. Обжечь инструменты, перенести вырезанный участок на плитку, надсечь экспланты в нескольких местах для появления в дальнейшем раневого каллуса. Поместить их в колбу или чашку Петри со стерильной средой, чуть вдавливая их пинцетом, для усиления контакта со средой. В одну чашку Петри помешают 5-10 эксплантов. Закрыть колбу или чашку Петри. Чашки Петри заклеить парафилмом или пищевой пленкой. Поместить в термостат без освещения и выдержать 3 недели при температуре 22–25 °C. Через 3 недели рассмотреть образовавшийся каллус.

Получение и культивирование каллусной ткани из зародышей пшеницы

Материалы и оборудование

Зрелые зерновки пшеницы, пробирки со стерильной средой Гамборга с добавлением 5 мг на литр 2,4-Д (см. прописи питательных сред для растительных клеток), стерильный пинцет, скальпель, кисточка, стаканчик с этанолом, 4 % хлорамин, чашка Петри, кафельная плитка, колба со стерильной водой, спиртовка, спички.

Каллусы, полученные из зародышей пшеницы, используют для селекции растений на солеустойчивость, засухоустойчивость, устойчивость к другим неблагоприятным факторам.

Ход работы

Семена пшеницы промыть водой с мылом, затем водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой. Поместить в чашку Петри, залить этанолом на 5 минут, этанол слить в стаканчик, залить хлорамином на 15 минут, трижды промыть стерильной дистиллированной водой, выдерживая по